蛋白質(zhì)提取檢測(cè)試劑適用于測(cè)定蛋白濃度在20-5000μg/ml樣品。測(cè)定前取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),若A測(cè)定管-A空白管﹥1.5,需將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定,以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸,因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),大吸收峰在280nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi),蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系,可作定量測(cè)定。 自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。試劑組成和配制:
試劑A:液體50mL×1瓶,4℃保存。試劑B:液體1mL×1支,4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)蛋白:液體2mL×1支,4℃保存。
工作液配制:臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積(樣本數(shù)×1mL),將試劑A和B按照50:1的比例混合,蓋緊后充分混勻。樣品中可溶性蛋白質(zhì)提?。?/div>
1.液體樣品:澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定。2.組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(自備),根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測(cè)液。3.細(xì)菌、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。測(cè)定操作:
1.分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到562?nm,蒸餾水調(diào)零。2.工作液置于60℃水浴預(yù)熱30min。